AMH結構及免疫活性原料介紹

* 來源: * 作者: admin1 * 發表時間: 2018-05-09 10:59:51 * 瀏覽: 3106

抗繆勒氏管激素（AMH），也被稱為繆勒氏管抑制因子（MIF）,繆勒氏管抑制激素（MIH），繆勒氏管抑制物質（MIS），是 140kDa，二聚體糖蛋白激素，是TGF-β超家族的一員。

一、背景

所有該家族的成員都是二聚體糖蛋白，在組織生長和細胞分化中起不同的調節作用。跟家族的其他成員一樣，AMH蛋白的合成首先是作為一個大的前體，包含18個信號氨基酸序列，再加工成前激素原，最終生成同型二聚體。分泌前，成熟的激素經歷糖基化和二聚體化，形成一個140kD的二聚體。二聚體由兩個完全一樣的70kD單體亞基，通過二硫鍵鏈接形成。每個單體由N端（即“pro”區）和C端（即“mature”區）組成。在細胞漿轉運過程中，70kD的AMH的單體會在“pro”區和“mature”區間的特定位點水解形成兩段多肽：58kD的“pro”區和12kD的“mature”區。水解后，這兩段多肽仍會以非共價形式結合。

二、基因及蛋白組成

編碼AMH的基因位于19號染色的短臂上，AMH的氨基酸序列見下圖

三、早期AMH的檢測試劑

國外早期的AMH檢測試劑（如DSL/IOT/Beckman Gen II等），對不同形式的AMH（如天然、重組（加工過或為加工））有不同的親和力。這些試劑的抗體即可以結合單體AMH也可以結合二聚體AMH，無法對其有效辨別。DSL/IOT兩種試劑，由于使用不同的抗體及不同的校準品，在測定同一樣品時，會得出不同的檢測結果；有研究表明，Gen II的測試結果會比DSL的低20-40%；但Gen II申報數據表明，Gen II的測試結果會比DSL的高出40%。這些數據表明，AMH在某些條件下存在形式并不穩定，且測試缺乏公認的檢測標準。這在一定時間內限制了AMH在生殖評估、科研轉化等方面的應用。

目前，國內的AMH檢測主要以Beckman Gen II的ELISA結果為參考依據，如Roche cobas AMH即將檢測結果溯源至此。

四、AMH的結構

AMH由兩個完全一樣的70kD單體亞基，通過二硫鍵鏈接形成。每個單體由560個氨基酸排列而成。一般情況下，同型二聚體或其他低聚體的亞基是對稱排列的。盡管有些例子表明，二聚體中的對稱性是可以被破壞的。在這種情況下，一個單體上可被抗體識別的位點，在另一條單體上可能無法被識別。目前，沒有理論或機理表明，AMH是一種對稱性被破壞的二聚體。因此，識別一條單體上位點的抗體，也可以識別另一條單體上的位點。

通過還原劑處理，二聚體AMH二硫鍵打開，AMH會形成兩條完全一致的單體。

在451氨基酸處，即—RAQR︱SAGA—存在水解位點，通過蛋白酶處理，全長AMH將分為兩段多肽，1-451氨基酸為“pro”區，452-560氨基酸為“mature”區。

水解后的AMH自發聚合，可形成非共價結合的水解-再結合形式的AMH。

移除信號肽（1-18）和7個前肽，AMH會產生2個片段，一個有26-451氨基酸；另一個有452-560氨基酸。后者為AMH的mature片段。26-451還可以繼續處理為兩個片段，一個為26-229，這里稱為N-ter-pro區，另外的230-451這里稱為midpro區。

盡管目前對于AMH在臨床相關樣本中的形式尚不明確，但是已知在哺乳動物代謝循環中可存在不同形式的AMH蛋白，在多種組織和細胞中也可確認有不同形式的AMH蛋白。

五、AMH抗體配對選擇舉例

AMH存在不同的形態。針對不同區域位點的抗體配對，對不同形態的AMH檢出有所不同。下圖例舉了針對不同位點的抗體

A、B位于“pro”區，C、D位于“mature”區（A、B、C、D僅為所處區域的指示，不代表特定位點的抗體）。

AMH是對稱性排列的二聚體，在夾心法ELISA中，同一抗體即可作為捕獲抗體用，也可作為檢測抗體用，如C-C（如無特殊說明，前者均作為捕獲抗體，后者均作為檢測抗體）這一配對可作為AMH的mature-mature區檢測。由于針對同一位點，該配對的檢測不受樣本水解與否的影響。類似的，A-A可作為AMH的pro-pro區檢測。C-D可作為AMH的mature-mature區檢測。A-C可作為AMH的pro-mature區檢測。D-B可作為AMH的mature-pro區檢測。

把每一組配對都用于試劑來測量同一樣本中AMH含量。結果如下表所示

	C-C	A-A	C-D	A-C	D-B
Sample	6.553	0.369	12.012	23.525	>19
Calibrators(OD value)
Blank	0.086	0.069	0.093	--	0.062
0.1ng/ml AMH	0.106	0.076	0.133	--	0.08
10ng/ml AMH	1.26	1.178	2.94	--	1.5

不同配對的試劑被認為測量樣本中不同的形態的AMH。C-C測量的是全長二聚體和mature區二聚體的AMH。C-D mature-mature區檢測，測量的是全長二聚體和單體，mature區單體和二聚體AMH。因為這一配對可檢測更多形態的AMH，所以測定的值要高于C-C的檢測。A-C的pro-mature區檢測，測量全長二聚體和單體，不能被C-D識別的全長和單體的AMH片段。因此，存在有的亞型可以被pro-mature檢出，但是不能被mature-mature識別。