25羥基維生素D生物活性原料的開發

項目背景

維生素D是脂溶性類固醇類衍生物，主要包括VD₂（麥角鈣化醇）及VD₃（膽鈣化醇）。在肝臟中，維生素D被羥基化為25羥基維生素D，多與維生素D結合蛋白（VDBP）結合，進入循環系統；25羥基維生素D是維生素D在血液中主要運輸形式，濃度高且穩定，半衰期長，其濃度被認為是評價維生素D水平的最佳指標^[1]。

據估計，全世界大約有30%-50%的兒童和成年人的血清25羥基維生素D缺乏，在妊娠婦女中尤為明顯^[2,3]。

原料難點

25羥基維生素D作為一個臨床有廣泛需求的項目，我們在發光、免疫熒光等平臺原料的研發過程中，遇到很多的困難，主要集中在以下方面：

l  小分子抗體的開發；

l  25(OH)D特異性抗體的開發；

l  兼容25(OH)D₂、25(OH)D₃、3-epi-25(OH)D₃抗體的開發；

l  25(OH)D₂、25(OH)D₃等特異性抗體的篩選；

l  抗體原料要有足夠的定量范圍，覆蓋臨床上“不足”與“過量”；

經過長期的研發工作，同仁心的研發團隊目前已成功開發了兩組配對，基本上解決了上述各問題。

同仁心25羥基維生素D原料概況

在化學發光、酶聯免疫、熒光紙條等免疫平臺，我們均推薦采用”競爭法”檢測本項目，根據具體檢測目標不同，我們推薦的原料組合如下：

組合1：抗體1C7可以同時識別25(OH)D₂及25(OH)D₃，配套抗原BSA-25(OH)D同時偶聯了25(OH)D₂及25(OH)D₃，該組合模式可以用于檢測樣本中的總25(OH)D;

組合2：抗體17E11能特異性識別25(OH)D₃，不存在和25(OH)D₂的交叉反應性，配套抗原BSA-25(OH)D₃僅偶聯25(OH)D₃，該組合可以用于特異性檢測樣本中的25(OH)D₃。

同仁心25羥基維生素D原料性能

?  VD₂&VD₃特異性競爭結果

數據可見，1C7對VD₂和VD₃都有明顯的競爭效果；17E11僅對VD₃有競爭效果。

?  靈敏度及檢測范圍

兩種組合模式，原料都可以實現3-300ng/ml范圍內的準確定量。（Roche試劑定量范圍：3-70ng/ml； Abbott試劑定量范圍：8-160ng/ml）

      ?  交叉反應性

注：Roche/Abbott為試劑說明書數據

?  對照原料的比較

科研人員選取了市場上部分主要的VD抗體，連同同仁心的抗體，進行了初步的性能評價：

在標記濃度相同的情況下，對抗體進行梯度稀釋，已考察抗體的活性：

可見，同仁心的抗體活性要明顯高于對照抗體。

此外，在競爭效果相近的情況下，比較了各組抗體的使用量：

數據可見，競爭效果相當的情況下，同仁心抗體使用濃度更低。

應用中的主要注意事項

1.     體系中鹽濃度建議≤50mm；

2.     體系中避免使用小牛、羊血清等動物來源，組分不明物質，避免外源25OHVD或動物其他蛋白干擾評價結果。

參考文獻               

[1] Holick MF Chen TC. Am J Clin Nutr 87(suppl),1080S – 1086S, 2008.

[2] Tao M, J Maternal Fetal Neonatal Med., 2012 Mar;25(3):237-9

[3] 《中國人群維生素D營養狀況》，吳光馳，中國婦幼衛生雜志，2010,1（1）：51-54

[4] 《維生素D與成年人骨骼健康應用指南（2014年標準版）》，中國老年學學會骨質疏松委員會維生素D學科組專家委員會：中國骨質疏松雜志，2014